Seeigelsex Protokoll

Als Ergaenzung zu Argent23's Post "Seeigelsex" auf Holiday Junction poste ich hier das original Protokoll der Giglio-Exkursion von 2006. Es soll ja Leute geben, die ein Mikroskop ihr eigen nennen und unter dieser einen Vorraussetzungen ist das Ganze eine wirklich spannende Urlaubsbeschaeftigung. Vielleicht stolpert ja auch der eine oder andere Kursteilnehmer bei der Vorbereitung der Versuche ueber diese Posts... Viel Spass!


Larvalentwicklung der Echinodermata

1. Einleitung

Stachelhäuter sind getrenntgeschlechtlich und pflanzen sich fort, indem sie Samenzellen und Eier direkt ins Wasser freisetzen. Das Geschlechterverhältnis ist dadurch bei vielen Arten zugunsten der Männchen auf etwa Drei zu Eins verschoben. Die meisten Arten haben pelagische Larven, die sich von Plankton ernähren. Im Gegensatz zu ihren Eltern sind die Larven bilateralsymmetrisch. Erst wenn sie sich auf dem Boden niederlassen verändert sich ihr Körper und zeigt die typische Radiärsymmetrie. In der Entwicklung der Larven wird außerdem der Urmund zum späteren After, und ein sekundärer Mund bildet sich, was die Echinodermata als Deuterostomier ausweist.
Seeigelembryonen werden daher, und weil sie leicht zugänglich und durchsichtig sind als Modellsystem für Entwicklungsvorgänge benutzt.


2.Gewinnung der Gameten

Wir benutzten für unseren Versuch den Schwarzen Seeigel, Arbacia lixula, der im Mittelmeerraum und so auch auf Giglio an allen Felsküsten häufig vorkommt.
Da die Tiere sehr empfindlich auf Kontakt mit der Luft reagieren, wurde einmal sofort am Strand versucht Eizellen und Sperma zu gewinnen, ein zweites Mal wurden andere Tiere erst im Labor der Prozedur unterzogen. Die Tiere wurden mit der Oralseite nach oben in ein Becherglas, gefüllt mit sterilfiltriertem Meerwasser, gesetzt. Zum Sterilfiltrieren hatten wir das Meerwasser mit einer Spritze und einem geeigneten Aufsatz durch einen Filter mit einer Maschenweite von 0,2μm gepresst.
Den Seeigeln wurde nun etwa 2ml Kaliumchlorid mit einer Injektionsspritze durch die Mundöffnung in die Leibeshöhle injiziert, was eine Depolarisation und ein Ausstoßen der Gameten bewirken sollte.
Dazu verwendeten wir am Strand versehentlich 30%iges (circa 5M) im Labor später 0,5 molares KCl. Trotzdem kam es bei beiden Ansätzen zu einem Ausstoßen von Gameten, wobei nicht alle Tiere wie gewünscht reagierten. Es zeigte sich dass eine schräge Injektion tief ins innere des Tieres die größte
Erfolgswahrscheinlichkeit mit sich bringt. Dies könnte daher rühren, dass so das Kaliumchlorid direkt in die Gonade seitlich unter der Apikalseite gespritzt wurde.



Folgende Tabellen zeigen die Anzahl männlicher und weiblicher Tiere, die Keimzellen ausstießen. Die Zahl in der Spalte BG gibt an wie viele Tiere weder Spermien noch Eizellen abgaben.

Strand
BG---männlich---weiblich
6------------3---------------2

Labor
BG---männlich---weiblich
4------------4---------------2


Durch die hohe Anzahl von Tieren unbestimmten Geschlechts macht eine Statistik der Geschlechterverteilung keinen Sinn. Die Gameten wurden mit einer Pipette vom Boden der Bechergläser entnommen und getrennt, gekühlt aufbewahrt.


Entwicklung der Embryonen

Wir gaben nun in zwei Petrischalen die am Strand erhaltenen Spermien zu den dort gewonnenen Eizellen und stellten eine der beiden Schalen kühl.
Ebenso verfuhren wir mit den erst im Labor erhaltenen Geschlechtszellen.
Nach der Befruchtung der bereits polar gebauten Eizelle(Polkörperchen am animalen Pol) wurde ein Eindringen weiterer Spermien durch eine Veränderung der Plasmamembran zur Befruchtungsmembran, die nun so genannte Corticalgranula als äußere Schutzschicht enthält, verhindert. Diese Befruchtungsmembran war bei allen Versuchsansätzen als dünner Kranz um die Zygote zu erkennen.





Auch die ersten beiden Furchungen, die das Ei entlang der animal-vegetativen Achse teilen konnten wir bei den bei Zimmertemperatur gelagerten Ansätzen nach ca.20 und 40 Minuten erkennen. Die im Kühlschrank gelagerten Embryonen erreichten nach etwa 20 Stunden dieses Stadium.





Nach etwa zwei Stunden hatten die Zimmertemperatur-Ansätze das 16-Zell-Stadium erreicht. Dieses entsteht nach der vierten inäqual verlaufenden Furchung und zeigt am vegetativen Pol vier kleine Mikromeren.





Nach etwa 5 Stunden befanden sich in den beiden bei Zimmertemperatur gelagerten Ansätzen bereits Blastulae. Auch die gekühlten Ansätze erreichten dieses Stadium, allerdings erst nach fünf Tagen.





Die darauf folgenden Stadien, zwischen Blastula und Larve, entwickelten sich über Nacht und konnten daher leider nicht dokumentiert werden.





Bei Beginn der Gastrulation wanderten vom vegetativen Pol etwa 40 primäre
Mesenchymzellen in das innere der Blastula. Dort stülpte sich der Darm ein, der dann mit dem Mund, der sich von der gegenüberliegenden Seite eingestülpt hatte, verschmolz.
Nach etwa 48 Stunden konnten wir im Ansatz, mit den am Strand gewonnenen
Gameten, der bei Zimmertemperatur gelagert wurde, Pluteuslarven entdecken.





Die Embryonen des im Labor gewonnenen Ansatzes waren von Pilzsporen oder
anderen Verunreinigungen zerstört. Auch die beiden im Kühlschrank gelagerten Ansätze starben nach fünf Tagen im Blastulastadium ab.
Wahrscheinlich war nur beim ersten Sterilfiltrieren des Meerwassers unser Filteraufsatz richtig dicht.
In unserem ersten Ansatz konnten wir nach drei Tagen sogar die beginnende
Metamorphose zum radiärsymmetrischen Tier beobachten. Es hatte sich am Boden der Petrischale mit einem radiärsymmetrischen Auswuchs angeheftet.

Vergleichende Entwicklungsgenomik- Zwei Paper und massig Fehlinterpretationen

In diesem Post möchte ich anhand zweier Papern diskutieren, was Evo-Devo im allgemeinen ist und eine Unterdisziplin, die man im Deutschen wohl am besten "Vergleichende Entwicklungsgenomik" nennt, vorstellen. Außerdem möchte ich zeigen, warum Arbeiten auf diesem Gebiet für unser Verständnis der Evolutionstheorie wichtig sind. Zum Schluss möchte ich noch einen verwandten Beitrag auf dem deutschen Researchblogging kritisieren und zeigen warum dieser Fehlinterpretationen und schlichte Fehlinformation enthält.

Evo-Devo (Evolutionary developmental biology) lässt sich am besten mit "Evolutionäre Entwicklungsbiologie" ins Deutsche übersetzen. Der Forschungszweig basiert darauf, dass natürliche Selektion oft nicht unmittelbar auf den Genotyp eines Individuums wirken kann, sondern auf den Phänotyp. Dieser Phänotyp wird durch ein komplexes genetisches Programm bei der Entwicklung des Organismus produziert. Bei einem solchen Entwicklungsprogramm sind die Mengen an Proteinen oder RNAs entscheidend; so können gewisse Schwellenwerte dieser Moleküle Zellschicksale beeinflussen und den Phänotyp bestimmen.
Eines der grundsätzlichsten Dogmen von Evo-Devo ist daher, dass Unterschiede in der Genexpression während der Entwicklung für unterschiedliche Phänotypen verantwortlich sind. Diese Expressionsunterschiede wiederum werden durch Unterschiede in nicht kodierenden, den Genen vorgelagerten (cis-)regulatorischen Sequenzen (hauptsächlich Promotoren und Enhancer) oder in den Protein-Sequenzen von übergeordneten Transkriptionsfaktoren verursacht (oder wiederum in der Expression dieser Transkriptionsfaktoren).
Evo-Devo will daher in die bisweilen postulierte Lücke zwischen Macro- und Microevolution vorstoßen. Gerade Experten auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie räumen mitunter die Möglichkeiten saltatorischer Evolution ein. Das heißt, sie halten Makromutationen für möglich, die in einem einzigen Mutationsschritt starke Änderungen des Phänotyps (sogenannte "Hopeful Monster") produzieren. Dies soll hauptsächlich durch Änderungen an wichtigen "Schaltstellen"-Transkriptinsfaktoren in den Entwicklungsprogrammen geschehen. Diese Sichtweise wird von der Mehrzahl der Evolutionsbiologen -bis auf Darwin selbst zurückgehend- abgelehnt. Die konventionelle Theorie besagt, dass Veränderungen durch graduelle Mutationen erfolgen, die sich über Generationen akkumulieren. Einzelne Wissenschaftler auf dem Gebiet der evolutionären Entwicklungsbiologie versuchen also mitunter Modifikationen an den bestehenden Fundamenten der Evolutionsbiolgie zu erreichen, was auf heftige Kritik (auch aus den eigenen Reihen) stößt. Wahrscheinlich ist Evo-Devo daher eines der lebendigsten Forschungsgebiete in der aktuellen Biologie.

Die von mir im Folgenden besprochenen Studie untersuchen beide dieses zentrale Dogma von Evo-Devo genauer und lassen meines Erachtens auch Schlüsse zur genannten Kontroverse zu.

Cretekos et al. benutzen dazu die Unterschiede im Wachstum der Vorderextremitäten zwischen Carollia perspicillata (einer Fledermaus) und der Maus. Beide Taxa stammen aus unterschiedlichen Ordnungen der Säugetiere Chiroptera (=Fledertiere) beziehungsweise Rodentia (=Nagetiere), teilen also einen gemeinsamen Vorfahren vor etwa 80-100 Millionen Jahren.
Die Studie betrachtet Veränderungen in Prx1, einem Transkriptionsfaktor, der durch klassische entwicklungsbiologische Methoden als wichtig in der Extremitätenentwicklung identifiziert wurde. Die Kollegen stellten beim Verglich der Gen-Sequenzen aus Maus und Fledermaus nur einen nicht-synonymen (in das Protein übersetzten)Unterscheid fest. Dieser Unterschied befindet sich in einem Bereich des Genes, der ohnehin wenig konserviert ist, und nicht mit der typischen Funktion des Traskriptionsfaktors in Verbindung gebracht wird.
Unterschiede in der Expression von Prx1 konnten in der späten Entwicklung der Vorderextremitäten festgestellt werden, in der Fledermaus war der Transkriptionsfaktor speziell im Bereich der Handwurzelknochen stärker exprimiert. Dieses Ergebnis korreliert gut mit dem zu diesem Zeitpunkt verstärkt auftretenden Längenwachstum in der Fledermaus.
Cretekos et al. betrachteten weiterhin also einen Enhancer "stromaufwärts" des Gens, der ebenfalls mit klassischen Methoden identifiziert worden war. Dieser Enhancer enthält zwei Bereiche die zwischen Nager und Fledertier relativ konserviert sind, in diesen wurde dann die Funktion vermutet. Um dies zu testen konnte die Gruppe die jeweilige Enhancer-Region an ein Reportegen koppeln und in Mäuse einbringen, dabei wurde stärkere Reporter-expression beim Chiroptera-Enhancer beobachtet.
Doch damit nicht genug, der Gruppe gelang es schließlich das Fledermaus-Kontrollelement in die Maus einzubringen, so dass es die Expression des Prx1-Gens steuert. Die entsprechenden Mäuse zeigten tatsächlich ein verstärktes Wachstum der Vorderextremitäten.
Die Studie konnte so eindrucksvoll das zentrale Dogma der evolutionären Entwicklungsbiologie bestätigen und weiterhin zeigen, dass die zugrunde liegenden Veränderungen im untersuchten Fall auf Enhancer-Elementen basieren.

Auch die Studie von Prabhakar et al. beschäftigt sich mit der Funktion von Enhancern, die betreffende genomische Region war aber mit anderen Mitteln identifiziert worden. Dabei wurden komplett sequenzierten Genome von Wirbeltieren nach konservierten, nichtkodierenden Sequenzen durchsucht. Aus diesen Sequenze wurden wiederum jene identifiziert, die in der Menschlichen Linie (entgegen des allgemeinen Trends) evolvieren. Diese Vorgehen basiert auf der Tatsache, dass Elemente mit einer bestimmten Funktion weniger evolvieren als funktionslose Elemente, ändern sie allerdings ihre Funktion erfolgt die Evolution sogar schneller als dies unter Neutralität (Funktionslosigkeit) der Fall wären. Die identifizierte Region liegt im Intron eines Gens, das mit der Funktion des Endosoms in Verbindung gebracht wird. Weier "stromäbwärts" befindet sich wieder ein Transkriptionsfaktor, dessen Wirkung die Entwicklung der Gliedmaßen beeinflusst. Die Expression welcher Gene genau der mögliche Enhancer beeinflusst ist also noch nicht geklärt.
Zur Untersuchung der Funktion der Enhancer-Region benutzten die Kollegen also wieder ein Reporterassay (ß-Galactosidase). Sie brachten die postulierten Kontrollelemente aus Rhesusaffen (Macaca mulatta), Schimpansen (Pan troglodytes) und dem Menschen (Homo sapiens) (Divergenz vor 6 bzw. 25 Mya) gekoppelt an das Reportergen, in Mäuse ein. So konnten die Forscher zeigen, dass die menschlichen Elemente im Vergleich zu denen aus beiden anderen Primaten, verstärkt Gene beim Wachstum der Extremitäten anschalten. Sie konnten so die durch den Genom-Verglich identifizierten Unterschiede bestätigen: Der Zustand und die Wirkung des Enhancers sind sich in nicht-menschlichen Affen ähnlich und entsprechen daher wahrscheinlich dem Zustand im gemeinsamen Vorfahren.
Mit sehr cleveren Experimenten bewiesen die Kollegen, dass genau die 13 Basen Unterschied im Menschen im Vergleich zu Schimpanse und Rhesusaffe den Unterschied ausmachen. Sie konstruierten Fragmente aus den beiden "Vierbeinern" in denen nur die betroffenen 13 Unterschiede eingebracht waren. Diese Konstrukte hatten die gleiche Wirkung wie das original-menschliche Element.

Die Studie konnte so, aufbauend auf dem zuvor beschriebenen zentralen Dogma von Evo-Devo, zeigen, dass durch Genomvergleiche die betreffenden Elemente identifiziert werden können. Ein denkbarer Name für ein solches Vorgehen ist "Vergleichende Entwiklungsgenomik" oder im Englischen "Comparative developmental genomics".

Weiter demonstrieren beide Studien eindrucksvoll die evolutionären Möglichkeiten für graduelle Veränderungen in Entwicklungsprogrammen. In beiden Beispielen konnte durch Veränderung einzelner Basen in regulativen Bereichen Unterschiede in der Genexpression erzeugt werden. Da es sich um Variationen in einzelnen Basenpaaren (SNPs) handelt, die langsam und nacheinander ins Genom einfließen, verlangen die hier beobachteten Unterschiede geradezu nach Gradualismus.

Fee hat vor einigen Wochen auf dem Blog Science-meets-spciety ebenfall über das letztere Paper geschrieben und ich möchte einige Fehler in diesem (auch auf Researchblogging erschienenen) Post abschließend korrigieren. Ich hoffe so eine Diskussion anzuregen, falls es im deutschsprachigen Raum genügend Interesse gibt.

S-M-S:

Wir teilen bis zu 98% der codierenden DNA mit unseren nächsten Verwandten, den Schimpansen (Pan troglodytes) und doch unterscheiden wir uns markant von ihnen.

Das stimmt nicht! Eine der grundlegendsten Entdeckungen der letzten Jahre waren Unterschiede in der Kopienzahl einzelner Gene im Menschlichen Genom. 2007 wurde so (Hauptsächlich durch den Vergleich der Genome von Venter und Watson) offensichtlich, dass einzelne Menschen sich in 2-3% ihres Genoms unterscheiden. Der Unterschied zu unseren nächsten interspeziefschen Verwandten dürfe daher mindestens 5% betragen.

S-M-S:

Der größte Teil der DNA in menschlichen Zellen ist nicht kodierend und wurde, als man dies entdeckte, fälschlicherweise als Junk-DNA (Abfall-DNA) verschrien.

Diese Sichtweise ist grundsätzlich falsch! Es wurden seit der Entdeckung nicht-kodierender Bereiche schon versucht Funktionen für diese für eine höhere Organisation zu postulieren. Vergleicht man aber unterschiedliche Organismen (z.B. der Zwiebel oder des Salamanders) mit der des Menschen oder der Kugelfische (Tetraodontidae; anderes Extrem) fällt schnell auf dass eine höhere Komplexität nicht mit der Genomgröße korreliert.
Die in Frage stehenden regulatorischen Elemente machen einen winzigen Teil des Genoms aus.

S-M-S:

Dabei stiessen sie auf einen Abschnitt von 546 Basenpaaren Länge, der sich seit der Entwicklung der Wirbeltiere nur wenig verändert hatte. Jedoch hatten sich in der relativ kurzen Zeit von 6 Millionen Jahren, seit sich die Entwicklungszweige von Mensch und Schimanse trennten, 16 Veränderungen etabliert, die alle in einem Abschnitt von 81 Basenpaaren clusterten. So etwas ist für einen genetischen Detektiv ein eindeutiges Indiz, dass weitere Untersuchungen gewinnbringend sein könnten.

Die Forscher wussten im Gegensatz zum Schreiber dieser Zeilen um die Existenz von Enhancen. Andernfalls hätten sie den entsprechenden Bereich nicht als solchen identifizieren können. In der besprochenen Studie wurden nicht zum ersten Mal Selektion auf einen nicht-kodierenden Bereich nachgewiesen. Ähnliche Fehlinterpretationen und die übertriebene Darstellung von Neuheiten (wissenschaftlichen Revolutionen) in der Wissenschaftsberichterstattung veranlassen auch beispielsweise Kreationisten regelmäßig zu ähnlichen Dummheiten.

S-M-S:

[...]so aktivierten alle die Expression von Genen in den Augen, Ohren und in den embryonalen Kiemenbögen, die später den Kiefer bilden.

Die Expression eines Reportergens! Dies ist im Vergleich zu den anderen Fehlern aber eher zweitrangig.

S-M-S:

Ein neuer Teilbereich der entwicklungsgenetischen Forschung, der bestimmt noch viele Überraschungen und neue Erkenntnisse birg.

Quatsch! "Vergleichende Entwicklungsgenomik" ist zwar ein recht neuer boomender Bereich der Entwicklunsbiologie, erfunden wurde er aber in diesem Paper nicht. Die Studie bestätigt vielmehr experimentell die Validität der zugrundeliegenden in silico Analysen.


Ich hab hier mal die jährliche Zähl an Veröffentlichungen, die "Comparative developmental genomics" im Volltext (Pub-med) erwähnen geplotet:


Dabei fällt auf, dass das erste Paper bereits aus dem Jahre 1988 stammt, als eigentlich noch keine Genome zum Vergleich bereitstanden. Veröffentlichungen vor dem Jahre 2001 können also wahrscheinlich als "Hintergrundrauschen" oder "Vorahnung" interpretiert werden, wirkliche "Comparative genomics" in dem heute etablierten Sinn waren damals noch kaum möglich. Ab diesem Zeitpunkt wurden dann anhand der vorhandenen Daten die betreffenden Methoden entwickelt. Prabhakar et al. haben also zwar eine schöne Studie angefertigt, mitnichten aber das "Teilgebiet" erfunden.

Kommentare/ Kritik erwünscht, ich bin kein Entwicklungsbiologe und habe sicher selbst Fehler gemacht!

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C. J. Cretekos, Y. Wang, E. D. Green, J. F. Martin, J. J. Rasweiler, R. R. Behringer (2008). Regulatory divergence modifies limb length between mammals Genes & Development, 22 (2), 141-151 DOI: 10.1101/gad.1620408

S. Prabhakar, A. Visel, J. A. Akiyama, M. Shoukry, K. D. Lewis, A. Holt, I. Plajzer-Frick, H. Morrison, D. R. FitzPatrick, V. Afzal, L. A. Pennacchio, E. M. Rubin, J. P. Noonan (2008). Human-Specific Gain of Function in a Developmental Enhancer Science, 321 (5894), 1346-1350 DOI: 10.1126/science.1159974

Nematoden als Hauptdarsteller

Phylogenetische Untersuchungen haben ein einfaches praktisches Problem:

Zeitaufwändig und mühevoll beschafft man die interessierenden Organismen aus aller Herren Länder, extrahiert DNA und ringt ihr die Sequenzen von einigen Markergenen ab. Man findet etwas wirklich interessantes und unerwartetes, doch nun gilt es zu beweisen dass das richtige Ausgangsmaterial ins Epi gewandert ist. Wenn es sich um einen kleinen Organismus (oder weniger anthropozentrisch: einen von normaler Größe) handelt, hat man diesen aber meist bei der DNA-Extraktion komplett in Proteinasen aufgelöst.

Da Taxonomen rar sind und sich der alles entscheidende, letzte überlebende[1] Experte (lüE) natürlich nichtmehr erinnern kann wie sicher er sich bei genau der in Frage stehenden Probe mit seiner morphologischen Bestimmung war, wäre es schön noch eine Dokumentation des entsprechenden Organismus zu haben. Strich-Zeichnungen, welche der lüE (nur dieser ist dazu fähig) angefertigt hat wären schön. Einzelne Bilder sind weniger befriedigend, da die interessierenden Strukturen nie alle auf einmal im Focus sind.

Wahrscheinlich hat besonders der chronische Mangel an morphologischen Merkmalen [2] bei Nematoden dazu geführt, dass sich Paul de Ley eine clevere Technik hat einfallen lassen, die dieses Problem löst.
Die possierlichen Rundwürmer werden dabei unter dem Mikroskop mit einer günstigen, handelsüblichen Digital-Videokamera gefilmt, wobei während der Aufnahme "durch den Wurm fokusiert" wird. Für den Betrachter des entstandenen Videoclips, entsteht so beim Bewegen des Abspielposition-Schiebers der Eindruck selbst am Mikroskop zu sitzen. Dieser Clip kann nun per Mail an den lüE geschickt werden und dieser kann die Artzugehörigkeit (aus morphologischer Perspektive) des sequenzierten Individuums bestimmen. Weiter kann der digital verewigte Wurm in einer Datenbank gespeichert und so der kritischen Fachwelt zugänglich gemacht werden.


[1] Wer helfen möchte die Taxonomen vor dem Aussterben zu bewahren, kann sich in diese Unterschriftenliste eintragen.

[2] Es gibt einige Nematoden, die eine ganze Reihe von ausgefallen morphologischen Merkmalen aufweisen, ich sollte einige dieser Viecher hier genauer vorstellen. Vielleicht gelingt es mir sogar regelmäßig, einen Nematoden der Woche (oder weniger optimistisch; des Monats) auszuwählen...


De Ley, P., De Ley, I.T., Morris, K., Abebe, E., Mundo-Ocampo, M., Yoder, M., Heras, J., Waumann, D., Rocha-Olivares, A., Burr, A.J., Baldwin, J.G., Thomas, W.K. 2005. An integrated approach to fast and informative morphological vouchering of nematodes for applications in molecular barcoding. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Vol. 360: p.1945-1958